Cryptococcus neoformans là gì? Các công bố khoa học về Cryptococcus neoformans

Một cặp dòng Cryptococcus neoformans var. neoformans bộc lộ kiểu giao phối đồng hợp tử, B-4476 (kiểu giao phối a) và B-4500 (kiểu giao phối alpha), được tạo ra với giả định chỉ khác biệt ở kiểu giao phối. Cặp này và con cháu của chúng, bao gồm năm dòng kiểu alpha và năm dòng kiểu a, đã được thử nghiệm về độc lực trên chuột. Trong các dòng cha mẹ cũng như con cháu, dạng alpha tỏ ra rõ ràng là có độc lực mạnh hơn so với dạng a. Ngoài ra, tử vong có xu hướng xảy ra sớm hơn ở chuột bị nhiễm dòng alpha so với chuột bị nhiễm dòng a. Những số liệu này mạnh mẽ chỉ ra mối liên hệ di truyền của sự độc lực với kiểu giao phối ở tác nhân nấm mốc gây bệnh ở người này.

Đánh giá độc lực của Cryptococcus neoformans trên một số vật chủ không phải động vật có vú cho thấy C. neoformans là một tác nhân gây bệnh không đặc hiệu. Chúng tôi sử dụng việc tiêu diệt sâu bướm Galleria mellonella (bướm sáp lớn hơn) bởi C. neoformans để phát triển một hệ thống mô hình vật chủ không xương sống có thể được sử dụng để nghiên cứu độc lực của nấm Cryptococcus, đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với nhiễm trùng và hiệu quả của các hợp chất kháng nấm. Tất cả các dạng của C. neoformans đã tiêu diệt G. mellonella. Sau khi tiêm vào xoang cánh của côn trùng, C. neoformans phát triển một cách nhanh chóng và, dù đã bị thực bào thành công bởi tế bào máu của vật chủ, đã giết chết sâu bướm ở cả 37°C và 30°C. Tỷ lệ và mức độ tiêu diệt phụ thuộc vào chủng Cryptococcus và số lượng tế bào nấm được tiêm vào. Chủng lâm sàng H99 của C. neoformans đã được giải trình tự là chủng nguy hiểm nhất trong số các chủng được thử nghiệm và tiêu diệt sâu bướm với liều tiêm thấp như 20 CFU/sâu bướm. Một số gen C. neoformans trước đây được cho là có liên quan đến độc lực ở động vật có vú (CAP59, GPA1, RAS1 và PKA1) cũng đóng vai trò trong việc giết chết G. mellonella. Liệu pháp kết hợp kháng nấm (amphotericin B cộng với flucytosine) được sử dụng trước hoặc sau khi tiêm đã hiệu quả hơn so với đơn trị liệu trong việc kéo dài sự sống và giảm tải lượng nấm Cryptococcus trong xoang cánh. Mô hình gây bệnh G. mellonella-C. neoformans có thể là một sự thay thế cho các mô hình động vật có vú về nhiễm trùng với C. neoformans và có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu độc lực nấm và hiệu quả của các liệu pháp kháng nấm trong thực nghiệm.

Hình thành vỏ nang đóng một vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của Cryptococcus neoformans. Để nghiên cứu cơ sở phân tử của quá trình tổng hợp vỏ nang, kiểu hình thiếu vỏ nang của một chủng đột biến được bù đắp bằng cách biến nạp. Một plasmid được tách ra từ kết quả của quá trình biến nạp Cap+ đã bù đắp cho đột biến cap59, được lập bản đồ trước đây bằng phương pháp phân tích tái tổ hợp cổ điển. Việc xóa gen bằng cách tích hợp tương đồng đã dẫn đến kiểu hình không có vỏ nang, chỉ ra rằng chúng tôi đã xác định được gen CAP59. Gen CAP59 được chỉ định trên nhiễm sắc thể I bằng phương pháp phân tích Southern blot của điện di phân giải trường điện đồng nhất ép viền của các nhiễm sắc thể của C. neoformans var. neoformans. So sánh trình tự genom và các bản sao cDNA đã chỉ ra sự hiện diện của sáu intron. CAP59 mã hóa một bản sao 1,9-kb và một protein suy ra có 458 axit amin. Phân tích trình tự nucleotide cho thấy ít sự tương đồng với các trình tự hiện có trong ngân hàng dữ liệu. Khi kiểu hình thiếu vỏ nang được hoàn thiện, chủng C. neoformans ban đầu không gây bệnh trở thành có khả năng gây bệnh cho chuột. Ngoài ra, chủng không có vỏ nang được tạo ra bằng cách xóa gen CAP59 đã mất khả năng gây bệnh. Công trình này chứng minh cơ sở phân tử cho khả năng gây bệnh liên quan đến vỏ nang và rằng gen CAP59 cần thiết cho quá trình hình thành vỏ nang.

Trong mô hình chuột bị nhiễm nấm Cryptococcus neoformans, các phản ứng Th1 (IL-12/IFN-γ) và Th17 (IL-23/IL-17) liên quan đến sự bảo vệ, trong khi phản ứng Th2 phụ thuộc vào IL-4 làm trầm trọng thêm bệnh. Để nghiên cứu vai trò của cytokine Th2 IL-13 trong quá trình nhiễm nấm C. neoformans ở phổi, các con chuột biến đổi gen quá sản xuất IL-13 (IL-13Tg+), thiếu hụt IL-13 (IL-13−/−), và lứa rừng (WT) đã bị nhiễm qua đường mũi. Độ nhạy cảm đối với nhiễm nấm C. neoformans được phát hiện khi IL-13 được gợi lên ở chuột WT hoặc quá sản xuất ở chuột IL-13Tg+. Những con chuột IL-13Tg+ bị nhiễm đã có thời gian sống sót ngắn hơn và lượng nấm trong phổi cao hơn so với chuột WT. Ngược lại, chuột IL-13−/− bị nhiễm tỏ ra đề kháng và 89% số chuột này sống sót suốt thời gian thử nghiệm. Sản xuất IL-13 đặc hiệu với kháng nguyên bởi chuột WT và IL-13Tg+ nhạy cảm có liên quan đến sự chuyển dịch đáng kể của cytokine kiểu 2 nhưng chỉ thay đổi nhẹ trong sản xuất IFN-γ. Phù hợp với sự gia tăng sản xuất cytokine kiểu 2, mức độ IgE trong huyết thanh cao và tỉ lệ IgG2a/IgG1 trong huyết thanh thấp được phát hiện ở chuột WT và IL-13Tg+. Thú vị là, biểu hiện của IL-13 bởi chuột WT và IL-13Tg+ nhạy cảm có liên quan đến giảm sản xuất IL-17. IL-13 được phát hiện kích thích sự hình thành của các đại thực bào thay thế hoạt động với sự biểu hiện của arginaza-1, thụ thể mannose của đại thực bào (CD206), và YM1. Ngoài ra, sản xuất IL-13 dẫn đến sự tăng sinh thương tổn của bạch cầu ái toan ở phổi, tăng sinh tế bào tiêu niệt và sản xuất nhầy tăng cường, và tăng cường phản ứng quá mẫn đường hô hấp. Điều này chỉ ra rằng IL-13 góp phần gây viêm dị ứng gây tử vong trong quá trình nhiễm nấm C. neoformans.

Gần đây, chúng tôi đã chứng minh rằng các đại thực bào dẫn xuất từ bạch cầu đơn nhân (MDM) của con người, được xử lý với chloroquine hoặc amoni clorua, đã làm tăng đáng kể hoạt động kháng nấm chống lại mầm bệnh liên quan đến AIDS là Cryptococcus neoformans. Cả hai chất này đều nâng cao độ pH của lysosome, cho thấy rằng hoạt động kháng nấm tăng lên là một chức năng của việc làm kiềm hóa phagolysosome. Hơn nữa, có một mối tương quan nghịch giữa sự tăng trưởng của C. neoformans trong môi trường không có tế bào và pH. Dữ liệu này cho thấy rằng C. neoformans đã thích nghi tốt để tồn tại trong các ngăn axit. Để kiểm tra giả thuyết này, chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu nhằm xác định pH của phagosome MDM và neutrophil ở người chứa C. neoformans. Nấm đã được dán nhãn với các dẫn xuất isothiocyanate của hai chất dò pH nhạy cảm: fluorescein và 2′,7′-difluorofluorescein (Oregon Green). Các chất dò này có pK_a là 6.4 và 4.7, tương ứng, cho phép phát hiện pH nhạy bén trên một dải rộng. pH của phagosome trung bình khoảng 5 sau khi hấp thụ nấm sống hoặc nấm bị tiêu hủy do nhiệt và duy trì tương đối ổn định theo thời gian, điều này cho thấy C. neoformans không chủ động điều chỉnh pH của phagosome của nó. Việc bổ sung 10 và 100 μM chloroquine dẫn đến sự tăng pH của phagosome từ mức cơ bản 5,1 lên đến 6,5 và 7,3, tương ứng. Cuối cùng, qua miễn dịch huỳnh quang, sự đồng định vị của C. neoformans và protein màng lysosome của MDM LAMP-1 đã được chứng minh, điều này thiết lập rằng sự hợp nhất của các phagosome chứa C. neoformans với các ngăn lysosome diễn ra. Như vậy, không giống như nhiều mầm bệnh nội bào khác, C. neoformans không né tránh sự hợp nhất với ngăn lysosome của đại thực bào mà cư ngụ và sống sót trong phagolysosome axit.

Vỏ polysaccharide ngoại bào được tạo ra bởi Cryptococcus neoformans là yếu tố cần thiết cho khả năng gây bệnh của nó. Chúng tôi đã phân lập và đặc điểm hóa một gen, (AP64, cần thiết cho sự hình thành vỏ bọc. Một chủng bọc kín được tạo ra bằng cách bổ sung đột biến cap64 gây ra nhiễm trùng gây tử vong ở chuột trong vòng 25 ngày, trong khi chủng không bọc cap64 không có độc lực. Xóa gen CAP64 từ một chủng loại hoang dã dẫn đến mất vỏ cũng như độc lực. Phân tích gel điện ly trường điện thống nhất cho thấy rằng CAP64 được đặt trên nhiễm sắc thể III, khác với vị trí của một gen liên quan đến vỏ khác, CAP59. Sự không liên kết giữa CAP64 và CAP59 cũng được ủng hộ bởi phân tích tái tổ hợp cổ điển. Tìm kiếm trong cơ sở dữ liệu không tiết lộ bất kỳ trình tự nào có độ tương đồng cao với CAP64. Chúng tôi cũng phát hiện rằng vị trí CAP64 nằm liền kề với một gen được phiên mã hội tụ có sự tương đồng đáng kể với gen mã hóa tiểu đơn vị proteasome của nấm men, PRE1. Khoảng cách giữa các đầu cDNA của hai gen này chỉ là 22 bp. Nghiên cứu này khẳng định bằng chứng di truyền phân tử trước đây rằng vỏ là yếu tố thiết yếu cho tính độc lực của C. neoformans trong mô hình chuột.